Mir-449b mejora el estado epigenético de embriones transgénicos de búfalo producidos mediante clonación artesanal
Resumen
El presente estudio tuvo como objetivo explorar los efectos de miR-449b sobre el estado epigenético de embriones transgénicos (que contienen el gen de la insulina humana) producidos mediante clonación hecha a mano. Para esto, se enuclearon ovocitos madurados in vitro mediante microcuchilla, se fusionaron dos demiooocitos con una célula somática (células transgénicas) mediante electrofusión y después de 1 h de electrofusión, los embriones fusionados (reconstrucciones) se incubaron en 40 nM de miR-449b imitador/ inhibidor por método de lipofección durante 1 h a 38,5°C en una incubadora de CO2. Después de la incubación, los cigotos transfectados se activaron químicamente y se sometieron a cultivo in vitro en medio RVCL (Cook®) durante 8 días a 38,5 °C en 5% de CO2 en aire y condiciones de humedad relativa de 90-95%. La transfección de mi-449b se confirmó a través de la fluorescencia roja producida por miR-449b [etiquetada con tinte fluorescente de 5 carboxitetrametilrodamina (TAMARA)] y el efecto de miR-449b sobre el estado epigenético se estudió mediante inmunofluorescencia y qPCR. Los embriones transgénicos mostraron un patrón de desarrollo similar al de los embriones del grupo control. Se comparó el nivel global de 5-metilcitosina entre tres grupos de embriones clonados transgénicos de búfalo producidos mediante el tratamiento de embriones reconstruidos con control, imitador e inhibidor de miR-449b. Se encontró que la intensidad media de los píxeles se redujo significativamente (p<0,05) cuando los embriones reconstruidos se cultivaron durante 2 h con un imitador de miR-449b en comparación con el control (imitado 7,92 ± 0,34 frente a control 16,15 ± 0,50). Al mismo tiempo, no fue significativamente mayor (p>0,05) cuando los embriones reconstruidos se expusieron al inhibidor de miR-449b en comparación con el control (inhibidor 17,18 ± 0,88 frente al control 16,15 ± 0,50). El nivel de expresión relativo de HDAC1 y DNMT1 se redujo significativamente (p<0,05), hasta 0,33 ± 0,39 veces y 0,16 ± 0,74 veces, respectivamente, en comparación con el control cuando se trató con el imitador de miR-449b. Al mismo tiempo, en el caso del inhibidor de miR-449b, el nivel de expresión del gen HDAC1 fue significativamente mayor (p<0,05) hasta 4,89±0,39 veces en comparación con el control. Sin embargo, en el caso de DNMT1, no hubo diferencia significativa (p<0,05) arrojando 1,17±0,66 veces en comparación con los embriones del grupo control. Este estudio reveló que el imitador de miR-449b reduce el nivel de metilación global de los embriones clonados transgénicos de búfalo, mejorando así la competencia y la calidad del desarrollo.
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